研究背景
自噬是细胞内一种通过双层膜结构的自噬体包裹并降解细胞质成分(如错误折叠蛋白、损伤细胞器和入侵微生物)的降解途径，对维持细胞稳态、细胞发育、免疫反应和细胞死亡至关重要，其失调与癌症、糖尿病和神经退行性疾病相关。自噬体的形成由ATG蛋白调控，其中ATG16L1是关键蛋白，它与ATG12-ATG5结合形成复合物，催化LC3脂化，促进自噬体形成，并参与细胞内细菌隔离、线粒体自噬及炎症调节。S-棕榈酰化是一种可逆的翻译后修饰，通过在半胱an酸残基上添加棕榈酰基团，影响蛋白质相互作用和膜结合，调节细胞信号传导和蛋白功能。
本篇文献“ZDHHC 7介导的ATG 16 L1的S-棕榈酰化促进LC 3脂化和自噬体形成”，主要为了探索ATG16L1的S-棕榈酰化位点及其对LC3脂化和自噬体形成的影响，以期阐明自噬调控机制。
研究内容
1. ATG16L1发生S-棕榈酰化
首先，通过酰基生物su交换（ABE）实验检测ATG16L1的S-棕榈酰化状态，发现HEK293T细胞中的内源性ATG16L1以及MCF7细胞中过表达的ATG16L1均显示出明显的生物su信号，表明ATG16L1是一个S-棕榈酰化蛋白。此外，使用棕榈酰化抑制剂2-溴棕榈酸(2-BP)处理细胞可显著降低ATG16L1的修饰水平，进一步证实了其S-棕榈酰化状态。实验还发现，自噬诱导(EBSS和Torin 1)可显著增加ATG16L1的S-棕榈酰化水平，而自噬抑制(VPS34-IN1)则降低其S-棕榈酰化水平，表明ATG16L1的S-棕榈酰化响应自噬信号。
2. ATG16L1的S-棕榈酰化位点
为了确定ATG16L1的S-棕榈酰化位点，研究者构建了多个截短突变体和位点突变体。通过ABE实验，发现ATG16L1的Cys153是主要的S-棕榈酰化位点。突变该位点(C153S)后，ATG16L1的S-棕榈酰化水平显著降低，表明Cys153是关键的修饰位点。
3. ATG16L1的S-棕榈酰化对LC3脂化的影响
作者利用ATG16L1基因敲除(KO)HeLa细胞系，发现ATG16L1的缺失导致LC3-II的缺失，而重新表达野生型ATG16L1可恢复LC3-II的生成。然而，表达S-棕榈酰化缺陷的ATG16L1-C153S突变体则无法恢复LC3-II的生成。在自噬诱导(EBSS或Baf-A1)条件下，野生型ATG16L1可显著促进LC3-II的生成，而ATG16L1-C153S突变体则无法响应自噬诱导，表明ATG16L1的S-棕榈酰化对LC3脂化过程至关重要。
4. ATG16L1的S-棕榈酰化对自噬体形成的影响
通过在ATG16L1-KO HeLa细胞中稳定表达EGFP-LC3，并重新表达野生型ATG16L1或ATG16L1-C153S突变体，研究者发现野生型ATG16L1可显著增加EGFP-LC3点状结构(自噬体标记)的数量，而ATG16L1-C153S突变体则无法恢复自噬体的形成。进一步通过GFP-RFP-LC3双荧光实验和透射电子显微镜(TEM)观察发现，野生型ATG16L1可促进自噬体和自噬溶酶体的形成，而ATG16L1-C153S突变体则无法促进这些结构的形成。此外，实验还表明ATG16L1的S-棕榈酰化缺陷不影响吞噬体的形成，但会抑制自噬体的成熟。
5. ZDHHC7介导ATG16L1的S-棕榈酰化
接着，通过共免疫沉淀(Co-IP)实验发现，ZDHHC7与ATG16L1相互作用，并且这种相互作用在自噬诱导条件下增强。进一步实验表明，ZDHHC7过表达可显著增加ATG16L1的S-棕榈酰化水平，而ZDHHC7的催化活性位点突变体(ZDHHC7-C160S)则无法促进ATG16L1的S-棕榈酰化。在ZDHHC7基因敲除(KO)细胞中，ATG16L1的S-棕榈酰化水平显著降低，而重新表达ZDHHC7可恢复ATG16L1的S-棕榈酰化，表明ZDHHC7是ATG16L1 S-棕榈酰化的关键酶。
6. ZDHHC7介导的ATG16L1 S-棕榈酰化对自噬的影响
在ZDHHC7-KO细胞中，LC3-II的生成和自噬体的形成受到抑制，而重新表达ZDHHC7可恢复这些过程，而ZDHHC7-C160S突变体则无法恢复。此外，ZDHHC7过表达可促进LC3-II的生成和自噬体的形成，而ZDHHC7-KO则抑制这些过程。这些结果表明ZDHHC7介导的ATG16L1 S-棕榈酰化在LC3脂化和自噬体形成中发挥重要作用。
7. ATG16L1的S-棕榈酰化对其相互作用的影响
研究者发现，ATG16L1的S-棕榈酰化对其与WIPI2B和RAB33B(WIPI2B通过招募ATG16L1复合物促进LC3脂化，而RAB33B则通过运输ATG16L1复合物确保其在吞噬体上的定位)的相互作用具有显著影响。野生型ATG16L1与WIPI2B和RAB33B的相互作用强于S-棕榈酰化缺陷的ATG16L1-C153S突变体。此外，ZDHHC7过表达可增强ATG16L1与WIPI2B和RAB33B的相互作用，而2-BP处理则削弱这种相互作用。这些结果表明，ATG16L1的S-棕榈酰化通过增强其与WIPI2B和RAB33B的相互作用，促进ATG16L1复合物在吞噬体上的募集，从而促进LC3脂化和自噬体的形成。
研究结论
本研究揭示了ZDHHC7介导的ATG16L1 S-棕榈酰化通过增强其与WIPI2B和RAB33B的相互作用，促进LC3脂化和自噬体的形成，从而为自噬的调控提供了新的分子机制。
Wei F, Wang Y, Yao J, Mei L, Huang X, Kong H, Chen J, Chen X, Liu L, Wang Z, Wang J, Song J, Kong E, Yang A. ZDHHC7-mediated S-palmitoylation of ATG16L1 facilitates LC3 lipidation and autophagosome formation. Autophagy. 2024 Dec;20(12):2719-2737. doi: 10.1080/15548627.2024.2386915. Epub 2024 Aug 11. PMID: 39087410; PMCID: PMC11587844.
研究背景
2. ATG16L1的S-棕榈酰化位点
3. ATG16L1的S-棕榈酰化对LC3脂化的影响
4. ATG16L1的S-棕榈酰化对自噬体形成的影响
5. ZDHHC7介导ATG16L1的S-棕榈酰化
6. ZDHHC7介导的ATG16L1 S-棕榈酰化对自噬的影响
7. ATG16L1的S-棕榈酰化对其相互作用的影响
研究结论
Wei F, Wang Y, Yao J, Mei L, Huang X, Kong H, Chen J, Chen X, Liu L, Wang Z, Wang J, Song J, Kong E, Yang A. ZDHHC7-mediated S-palmitoylation of ATG16L1 facilitates LC3 lipidation and autophagosome formation. Autophagy. 2024 Dec;20(12):2719-2737. doi: 10.1080/15548627.2024.2386915. Epub 2024 Aug 11. PMID: 39087410; PMCID: PMC11587844.
